หลังพ้นตำแหน่ง ผู้ว่าราชการกรุงเทพมหานคร เมื่อครบวาระ 4 ปี สมัครตัดสินใจไม่ลงสมัครรับเลือกตั้งเป็น ผู้ว่าราชการกรุงเทพมหานคร สมัยที่ 2 แต่เบนเข็มมาลงสมัครรับเลือกตั้งเป็น สมาชิกวุฒิสภา กรุงเทพมหานคร ในการเลือกตั้งสมาชิกวุฒิสภา พ.ศ. 2549

ผลการนับคะแนน สมัคร สุนทรเวช ได้รับเลือกเป็นสมาชิกวุฒิสภา ด้วยคะแนนเสียง เป็นอันดับสองของประเทศ รองจาก ร.ต.อ.นิติภูมิ นวรัตน์ ที่ได้คะแนนเสียงเป็นอันดับที่ 1 แต่ ร.ต.อ.นิติภูมิ ยังไม่ทันได้รับการรับรองตำแหน่งสมาชิกวุฒิสภา จาก คณะกรรมการการเลือกตั้ง เนื่องจากมีผู้ร้องเรียน เรื่องการไปขึ้นเวทีปราศัยของ พันธมิตรประชาชนเพื่อประชาธิปไตย ที่อาจถือได้ว่าเป็นการ "หาเสียง" และขัดต่อกฎหมายเลือกตั้ง ก่อนที่จะมีการชี้ขาดเรื่องดังกล่าว การเลือกตั้งวุฒิสภา พ.ศ. 2549 ก็ได้ถูกยกเลิก เนื่องจากเหตุการณ์รัฐประหาร 19 กันยายน พ.ศ. 2549 ทำให้สมัครต้องพ้นจากตำแหน่ง โดยไม่มีโอกาสได้ปฏิบัติหน้าที่ใด ๆ ในฐานะสมาชิกวุฒิสภา